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    本發明提供一種活化纖維蛋白溶酶原的抗體，其係由寄存於食品工業研究所編號BCRC 960433之融合瘤細胞所產生。本發明另提供上述抗體的用途及製備方法，以及一種用於治療中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之製劑。
    公开号:TW201319089A
    申请号:TW100149177
    申请日:2011-12-28
    公开日:2013-05-16
    发明作者:Trai-Ming Yeh；Yung-Chun Chuang
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    活化纖維蛋白溶酶原之抗體、其用途與製備方法以及含有其之製劑
    本發明係關於一種抗體、其用途與製備方法以及含有其之製劑，特別關於一種活化纖維蛋白溶酶原之抗體、其用途與製備方法以及含有其之製劑。
    血管栓塞所導致的中風或心臟病等急性病症可能造成永久性神經損害或昏迷，如果不及時診斷和治療甚至可能引起其他併發症和死亡。在美國，中風已是成年人的第三大死因，而與歐洲相同地，中風同時是導致成人殘疾的首因。至於心臟病則更是位居全球死因的首位，在世界各地影響極大。
    造成中風或心臟病的主要成因是血栓的形成。概略而言，血栓是血管受傷破裂後引發凝血機制所產生，其構成的大部分成份是纖維蛋白(fibrin)。因此，在討論如何治療或預防中風或心血管疾病時，已有多項技術著重於促進纖維蛋白溶酶(plasmin)的纖維蛋白溶解作用(fibrinolysis)。纖維蛋白溶酶係由纖維蛋白溶酶原(plasminogen)經由組織纖維蛋白溶酶原活化子(tissue plasminogen activator,tPA)以及尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase plasminogen activator,uPA)活化後轉變而成，具有促使纖維蛋白分解之功能。針對此機制，習知技術則係著重於透過靜脈注射tPA或是額外提供水蛭素(hirudin)以促進纖維蛋白溶酶原的活化，而達到分解血栓中纖維蛋白以清除血栓的目的。雖然此種療法可以達到急救的效果，然而卻會有極高機率會引發出血的嚴重副作用。
    因此，如何針對上述致病機轉提供一種治療手段，藉由活化纖維蛋白溶酶原以清除血栓而達到治療或預防相關疾病的功效，已成為目前醫療領域中的重要課題之一。
    有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種可活化纖維蛋白溶酶原以促使纖維蛋白分解而達到治療或預防相關疾病之抗體、其用途及製備方法以及含有該抗體之製劑。
    因此，為達上述目的，本發明提供一種活化纖維蛋白溶酶原的抗體，其係由寄存於食品工業研究所編號BCRC 960433之融合瘤細胞所產生。
    在本發明中所稱之「融合瘤細胞」係取自動物體中具有可產生專一性抗體之細胞，如淋巴細胞，與另一細胞進行融合後在適當培養環境下可持續不斷進行分裂者。其中，所稱之「動物體」主要係包括但不限於可被任一血清型之登革病毒感染之動物宿主，較佳是包括哺乳類動物如人類、猴、鼠、牛、羊、狗、貓、或豬等。
    在本發明一實施例中，融合瘤細胞係利用骨髓瘤細胞與登革病毒免疫化脾臟細胞融合產生。
    在本發明一實施例中，抗體係對一胺基酸序列具有專一性，胺基酸序列係至少包括白胺酸-脯胺酸-X-脯胺酸，其中X係為任一胺基酸殘基。
    在本發明一實施例中，抗體同時具有登革病毒E蛋白與纖維蛋白溶酶原結合能力。
    在本發明一實施例中，抗體係藉由絲胺酸蛋白分解酶活性活化纖維蛋白溶酶原以生成纖維蛋白溶酶。
    在本發明一實施例中，抗體係與纖維蛋白溶酶原活化子共同作用。
    本發明另提供一種將上述抗體用於治療或預防中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之用途。而關於「治療」一詞，意指一動物體被診斷出具有中風或心肌梗塞等血栓或纖維蛋白凝結所引發之症狀、或具有發生該些症狀之傾向，而於提供一特定物質後，達到該些症狀之移除或減緩、治癒、改善、緩解、緩和、減輕或改進其病癥、或是避免該些症狀惡化之效果。此外，本發明又提供將上述抗體用於溶解纖維蛋白之用途。
    本發明又提供一種用於治療中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之製劑，其至少包括上述抗體。
    在本發明一實施例中，製劑更包括一安定劑、一活化劑、一界面活性劑、一抗氧化劑及/或防腐劑、或一纖維蛋白溶酶原活化子。
    本發明又提供一種活化纖維蛋白溶酶原之抗體的製備方法，包括以下步驟：利用一登革病毒免疫一動物；融合動物之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞；以及篩選生產對登革病毒E蛋白或纖維蛋白溶酶原具專一性之抗體之融合瘤細胞，並取得抗體。
    在本發明一實施例中，上述之製備方法中，登革病毒E蛋白或纖維蛋白溶酶原具有一胺基酸序列，其係至少包括白胺酸-脯胺酸-X-脯胺酸，其中X係為任一胺基酸殘基(residue)。
    在本發明一實施例中，上述之製備方法中，抗體係藉由絲胺酸蛋白分解酶活性活化纖維蛋白溶酶原以生成纖維蛋白溶酶。
    在本發明一實施例中，上述之製備方法中，抗體係與纖維蛋白溶酶原活化子共同作用。
    綜上所述，本發明所提供之抗體，能結合纖維蛋白溶酶原，並藉以由活化纖維蛋白溶酶原轉變為纖維蛋白溶酶，再透過纖維蛋白溶酶的酵素活性降解纖維蛋白原及/或纖維蛋白，因而能分解血管中的血栓或其他纖維蛋白凝結物，避免堆積而阻塞血流。是以，本發明所提供之抗體可用於治療或預防中風、心肌梗塞、或其他血栓引發的疾病，以提升健康品質，取代傳統具有高副作用風險的療法。
    以下將參照相關圖式，說明依本發明提供之一種活化纖維蛋白溶酶原之抗體、其用途與製備方法以及含有其之製劑。
    本發明於一實驗例證實，當登革病毒(Dengue virus,DENV)感染一動物體時，該動物體內能產生對登革病毒具有專一性的抗體。當中，對登革病毒之E蛋白具有專一性的一抗體所辨識的抗原決定區(epitope)係與該動物體內之纖維蛋白溶酶原(plasminogen，簡稱plg)的一段胺基酸序列相似。進一步證實，該抗體同時也能與纖維蛋白溶酶原結合。其中，該動物體係為老鼠。
    上述胺基酸序列係包含白胺酸-脯胺酸-X-脯胺酸(Lue-Pro-X-Pro)，其中X可為任一胺基酸殘基，較佳是白胺酸或絲胺酸。
    進一步而言，該抗體因具有酵素之催化能力，故當其與纖維蛋白溶酶原結合後，能使纖維蛋白溶酶原切割出一片段，從而轉化成具有分解纖維蛋白功能之纖維蛋白溶酶。在本發明一實施例中，該抗體係具有一種絲胺酸蛋白酶或絲胺酸蛋白分解酶活性，其作用係透過胺基酸序列中被活化之絲胺酸而達成，使纖維蛋白溶酶原生成為纖維蛋白溶酶。
    由於中風、冠狀動脈性心臟病或心肌梗塞等由血栓引起的急性病症，主要皆係由於血管受到纖維蛋白或其形成的血塊阻塞所引起，因此本發明提供具有上述特性之抗體，藉由其可活化纖維蛋白溶酶原成為之纖維蛋白溶酶功能，促進纖維蛋白原及/或纖維蛋白分解作用(fibrolysis)的發生，或強化纖維蛋白原及/或纖維蛋白分解作用，以治療或預防上述病症或癥狀。
    是以，依據本發明一實驗例，可自小鼠體內分離出被登革病毒免疫且具有製造抗體能力之脾臟細胞與骨髓瘤細胞株(myeloma cell line)進行融合，收集所得到的融合瘤(hybridoma)細胞，並以經過免疫方法如酵素連結免疫吸附法(ELISA)偵測及篩選對於登革病毒E蛋白及纖維蛋白溶酶原同時具有專一性的抗體，以挑選出相對應之融合瘤細胞，作為單株抗體之來源。關於融合瘤細胞之製備及後續抗體之篩選技術係為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所能理解者，故在此不多做贅述。所得之單株抗體中，能同時專一性地辨認登革病毒E蛋白及纖維蛋白溶酶原的一單株抗體係命名為6H11，其序列係如序列表SEQ ID NO：1所列，而製造該單株抗體6H11之融合瘤細胞則寄存於中華民國食品工業研究所，編號為BCRC 960433。以下，將以此抗體及融合瘤細胞為例具體說明本發明之內容，但非用於限制本發明之範圍。
    在本發明實驗例中，將單株抗體6H11提供於小鼠後，發現其體內之纖維蛋白溶酶量增加，且纖維蛋白分解後之產物如D-二聚體(D-dimer)濃度也同樣增加，可知由寄存於中華民國食品工業研究所編號為BCRC 960433之融合瘤細胞所產生之單株抗體6H11確實具有治療或預防中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之用途。同樣地，本發明之單株抗體亦具有溶解纖維蛋白之用途。
    本發明之抗體可透過靜脈注射、腹腔注射、或直接於患部注射等途徑供給於患者。在此所謂之「患者」係指出現血栓及其所引發之急性病症如中風或心肌梗塞者，或是已有血栓癥兆出現，但尚未引發血管栓塞及其併發症如中風或心肌梗塞者。具體而言，「患者」在此主要係針對哺乳類動物，較佳係為人類。另外，本發明之抗體在用於治療或預防中風、心肌梗塞、或血栓性疾病，或溶解纖維蛋白時，所使用之劑量可隨症狀輕重、纖維蛋白凝結程度、血栓生成之嚴重程度、血管栓塞程度及不同動物體而有所不同，舉例來說，若施用於老鼠，則依據老鼠體重，平均每克體重增加1~5 μg抗體量。
    在本發明一實施例中，抗體可同時與促進纖維溶解作用之相關因子共同作用，該些相關因子除本身單獨具有活化纖維蛋白溶酶原以生成纖維蛋白溶酶來促進纖維蛋白降解之活性外，同時更能加速本發明抗體促進纖維蛋白溶酶原生成纖維蛋白溶酶的作用。其中，纖維蛋白溶酶原活化子可包括組織纖維蛋白溶酶原活化子(tissue plasminogen activator，簡稱tPA)以及尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase plasminogen activator，簡稱uPA)。較佳地，纖維蛋白溶酶原活化子係為uPA。
    本發明另提供一種製劑，其可用於治療中風、心肌梗塞、或血栓性疾病。該製劑係包括上述之活化纖維蛋白溶酶原的抗體，其可由寄存於食品工業研究所編號BCRC 960433之融合瘤細胞所產生。該抗體較佳係為上述之抗體6H11，更佳係其胺基酸序列具有與序列表SEQ ID NO：1所列之序列至少85%相同，又更佳係至少90%序列相同，又再更佳係至少95%序列相同者。至於，該抗體的其他性質與特徵皆與前述相同，於此不再贅述。
    除此之外，在本發明一實施例中，製劑可更包括一活化劑、一安定劑、一界面活性劑、一抗氧化劑及/或防腐劑、或一纖維蛋白溶酶原活化子。其中，安定劑可例如甘胺酸、甲硫胺酸、鹽酸半胱胺酸、白胺酸、鹽酸離胺酸、鹽酸精胺酸、天門冬胺酸及其鹽類所組成，以延長本發明之製劑之保存。當然，依照施用之對象之不同，而可另外以等張劑如多元醇或緩衝劑如麩胺酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸及其他有機緩衝鹽等調整製劑至適合該動物體之酸鹼值或等張壓力等的生理環境。另外，纖維蛋白溶酶原活化子可與本發明之抗體共同作用，以輔助抗體加速施用對象體內生之纖維蛋白溶酶原生成為纖維蛋白溶酶，從而提升清除血栓的速率。其中，纖維蛋白溶酶原活化子可以為組織纖維蛋白溶酶原活化子(tPA)或尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子(uPA)至少其中之一，當然可以兩者同時並存。而關於製劑中所含之抗體含量係依據症狀輕重、纖維蛋白凝結程度、血栓生成之嚴重程度、血管栓塞程度、施用對象以及施用途徑之不同而有所差異。當然，其他成分也可依抗體所佔比例對應調整。
    本發明之製劑可依照患者病況、患部位置或載劑的承載傳送方式以及欲發揮作用之時間選擇以靜脈內、動脈內、肌肉內、滑液囊內、腹腔內、大腦內、或甚至口內途徑至患部發揮作用。在本發明一實施例中，係以靜脈注射方式給予施用對象。
    本發明又提供一種活化纖維蛋白溶酶原之抗體製備方法，其步驟包括利用一登革病毒免疫一動物、融合動物之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞以及篩選生產對登革病毒E蛋白或纖維蛋白溶酶原具專一性之抗體之融合瘤細胞，並取得抗體。而關於利用一登革病毒免疫一動物以及融合動物之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之步驟係已經詳述於上述內容中，而對於篩選生產對登革病毒E蛋白或纖維蛋白溶酶原具專一性之抗體之融合瘤細胞，並取得抗體之步驟係為本領域熟習此技藝者所能了解，故在此便不再贅述。惟要說明的是，上述抗體較佳係同時對登革病毒E蛋白及纖維蛋白溶酶原具專一性。
    以本發明之製備方法所獲得之抗體，具有與上述內容相同之特徵，故在此不再贅述。
    以下，本發明將提供多個以單株抗體6H11為代表的實驗例，說明本發明之一種活化纖維蛋白溶酶原之抗體、其用途與製備方法、及含有其之製劑，並證明本發明該抗體具有用於治療中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之用途。 實驗例一：製備對登革病毒E蛋白或纖維蛋白溶酶原之專一性單株抗體 受試血清
    純化免疫使用之病毒。準備32個受DENV-2(即第二種血清型之登革病毒)感染之患者血清，48個受DENV-3(即第三種血清型之登革病毒)感染之患者血清。另取得20個C型肝炎(HCV)患者及14個健康個體的血清供對照組使用。而關於病毒之純化方法係為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所能理解者，故將不再贅述。 登革病毒免疫小鼠，並製備融合瘤細胞以產生具有專一性之單株抗體
    取5隻6週大的母BALB/c小鼠，並個別以腹腔注射混合於弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant)的登革病毒50 μg，控制組則注射PBS，每隔兩週重複進行注射，共進行3次注射。細胞融合前3天，每隻老鼠再各注射抗原50 μg，其係為溶於PBS的DENV。利用ClonaCell-HY kit(Stemcell Technologies Inc.,Vancouver,BC,Canada)將小鼠之脾臟細胞(splenocyte)與小鼠骨髓瘤細胞(簡稱FO細胞)融合，再以培養基HAT-based selection medium篩選融合成功之融合瘤細胞。
    接著，以稀釋方式取得單一顆融合瘤細胞。收集該細胞上清液中的抗體，並以ELISA方法偵測該抗體是否對於登革病毒及纖維蛋白溶酶原具有專一性。為分離出單株抗體，係將融合瘤細胞分別打入pristine-primed BALB/c小鼠並反應約7至10天。利用純化手段protein G sepharose beads(GE Healthcare,Sweden)或protein L resin(GenScript Corp.,Piscataway,NJ)純化小鼠腹水中的免疫球蛋白IgG及IgM，即為所稱之單株抗體。抗體最後以PBS透析後於-20℃保存。 以ELISA測定單株抗體對登革病毒之專一性
    取含有含量5 μg/ml之纖維蛋白溶酶原的碳酸鹽/重碳酸鹽覆蓋緩衝液(carbonate/bicarbonate coating buffer，濃度0.5 M，酸鹼值pH 9.6)50 μl，分別覆蓋(coating)96孔ELISA盤(GeneDireX,Las Vegas,NV)之孔槽，並放置於溫度4℃環境中隔夜。接著，以含有濃度1%之牛血清蛋白(BSA)的磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)阻斷(blocked)反應。其後分別加入前述實驗例所得之單株抗體。抗體於溫度37℃環境下作用1小時，再加入稀釋5,000倍之辣根過氧化酶-連結山羊抗老鼠二級抗體(HRP-conjugated goat secondary antibodies against mouse,Zymed,San Francisco,CA)作用。最後以受質3,3’,5,5’-tetramethylbenzedine(TMB)進行呈色反應10分鐘，再以濃度2N之硫酸終止呈色反應。測定450 nm波長的吸光值(OD450)作為判斷依據。
    結果如表1所示，證實前述實驗例得到6株可同時與纖維蛋白溶酶原及登革病毒之E蛋白結合的單株抗體，特別是單株抗體6H11。其中，產生該單株抗體6H11之融合瘤細胞業已寄存於中華民國食品工業研究所，編號為BCRC 960433。參考圖1所示數據可知，單株抗體6H11同樣能與纖維蛋白溶酶原專一性地結合，並且係呈現劑量依賴關係，因此以下實驗例將以單株抗體6H11為代表，繼續進行實驗及分析。
    實驗例二：單株抗體6H11辨識胺基酸序列L-P-X-P
    利用噬菌體展示隨機胜肽庫套組(phage-displayed random peptide library kit,PhD 12-mer,New England Biolabs,Ipswich,MA)分析單株抗體6H11專一辨識之抗原決定區的胺基酸序列。其中，關於操作噬菌體展示隨機胜肽庫套組及噬菌體庫之建立方法係為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所能理解者，故不多加贅述。接續，再分析能與單株抗體6H11專一性結合之陽性噬菌體株的DNA序列。
    結果如表2及表3所示，表現有能被單株抗體6H11辨識之抗原決定區的噬菌體共有10株。其中9株噬菌體具有相同的序列，而只有第2株噬菌體的序列與其他噬菌體株有微小的差異。在這些抗原決定區中，均具有同樣的胺基酸基序(motif)，即為L-P-X-P。同樣地，該胺基酸基序亦分別出現在第一、二及四種血清型之登革病毒E蛋白之第216至219胺基酸位置、第三血清型之登革病毒E蛋白之第214至217胺基酸位置以及纖維蛋白溶酶原之第686至689胺基酸位置。顯示，單株抗體6H11專一性辨識的胺基酸序列係為L-P-X-P，且此片段係同時存在於登革病毒E蛋白及纖維蛋白溶酶原中。
    綜合實驗例一之結果可知，單株抗體6H11因能專一性地辨識胺基酸序列L-P-X-P，故同時具有與登革病毒E蛋白及纖維蛋白溶酶原結合的能力。 實驗例三：單株抗體6H11相關活性分析 單株抗體6H11活化纖維蛋白溶酶原測試
    濃度1 μM的纖維蛋白溶酶原與單株抗體6H11(30 μg/ml或150 μg/ml)培養約1至24小時。再將兩者之混合液與濃度1 mM之纖維蛋白溶酶呈色受質(substrate)S-2251作用，其中S-2251的濃度達到551.6 μg/ml。偵測OD405的變化值。
    單株抗體6H11在24小時內以濃度依賴(dose-dependent)及時間依賴形式(time-dependent)活化纖維蛋白溶酶原生成纖維蛋白溶酶的結果如圖2A及2B所示。明顯可見，相較於改加入沒有專一性之免疫球蛋白IgG或只有纖維蛋白溶酶原之控制組而言，單株抗體6H11之實驗組OD值持續上升，可知是單株抗體6H11隨著濃度或時間的增加活化了纖維蛋白溶酶原生成纖維蛋白溶酶，以和呈色受質S-2251反應所造成。 單株抗體6H11之絲胺酸蛋白分解酶活性分析
    另外，透過可呈色的絲胺酸蛋白分解酶受質S-2288以測定單株抗體6H11的絲胺酸蛋白分解酶活性。區分不使用或使用不同稀釋倍數濃度之Roche Complete protease inhibitor cocktail(Roche Diagnostics Ltd,Mannheim,Germany)之組別，使濃度300 μg/ml之單株抗體與受質S-2288(濃度為1 mM，即551.6 μg/ml)進行反應約2至24小時後同樣測定OD405的變化值。
    測定結果如圖2C所示，當加有蛋白分解酶抑制劑(protease inhibitor，簡稱PI)時，OD405值並不會隨著時間增加而上升，表示單株抗體6H11隨蛋白分解酶抑制劑濃度增加而能水解的絲胺酸蛋白分解酶受質S-2288量逐漸降低，證實單株抗體6H11具有絲胺酸蛋白分解酶之酵素活性。 纖維蛋白溶酶原活化子強化單株抗體6H11之作用分析
    濃度1 μM的纖維蛋白溶酶原及尿激酶(最終作用濃度為3 U/ml,sigma-Aldrich)與單株抗體(30 μg/ml)培養約1~120分鐘。再將三者之混合液與1 mM的纖維蛋白溶酶的呈色受質(substrate)S-2251作用(551.6 μg/ml)。偵測OD405的變化值。
    另外，如圖2D所示，單株抗體6H11與纖維蛋白溶酶原及尿激酶作用120分鐘時，相較圖2B於2小時所測得之OD405數值明顯大幅上升，顯示單株抗體6H11在含有尿激酶的添加下，加速了纖維蛋白溶酶受質S-2251的水解，證實在尿激酶的存在下能使單株抗體6H11加速纖維蛋白溶酶原的活化轉變成纖維蛋白溶酶。 纖維蛋白原切割分析
    濃度100 μg/ml之單株抗體6H11先與濃度1 μM纖維蛋白溶酶原(plg)於37℃環境下培養36小時；另兩組則係改以尿激酶(最終作用濃度為3 U/ml,sigma-Aldrich)或非專一性的免疫球蛋白IgG取代單株抗體6H11與纖維蛋白溶酶原反應。
    由於上述各組中分別加有濃度100 μg/ml之纖維蛋白原(Fbg)，故培養12小時後，反應結果以濃度10%之SDS-PAGE及西方墨點法(Western blot)分析如圖2E所示。其中，西方墨點法分析係採用兔子抗纖維蛋白原β及γ鏈多株抗體(rabbit anti-fibrinogen β and γ chain polyclonal antibody,GeneTex,San Antonio,TX)作為一級抗體，再以辣根過氧化酶-連結山羊抗兔子免疫球蛋白(稀釋10000倍，HRP-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin antibodies,Sigma-Aldrich)作為二級抗體，以進行呈色觀察結果。
    結果如2E所示，當纖維蛋白溶酶原及纖維蛋白原與單株抗體6H11培養後，纖維蛋白原的4個主要組成片段Aα聚合物、Aα鏈、Bβ鏈及γ鏈被分解成為小片段，同樣的結果可在加有尿激酶的正對照組中觀察到。是以，單株抗體6H11能活化纖維蛋白溶酶原並促進纖維蛋白原之分解。 實驗例四：單株抗體6H11活化小鼠體內(in vivo)之纖維蛋白溶酶原及纖維蛋白的分解
    取六週大BALC/c母小鼠(購自國立成功大學動物實驗中心，台灣)，共8隻。
    5隻BALC/c母小鼠分別靜脈注射50 μl之單株抗體6H11，3隻作為控制組注射免疫球蛋白IgG。每隻小鼠平均每克體重注射2.5 μg的抗體量。48小時後抽取每隻小鼠血液400 μl，收集在含有100 μl的濃度3.2%之檸檬酸鈉(sodium citrate)的管子中，以2,500×g離心15分鐘，以收取血液中的少血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。為偵測單株抗體6H11注射後血液中纖維蛋白溶酶的活性變化，取10 μl的PPP與S-2251(濃度為1 mM)共同培養2小時。接著，讀取OD405數值(VersaMax microplate reader,Molecular Devices)。另以競爭型小鼠D-dimer ELISA套組(competition-based mice D-dimer ELISA kits,BlueGene;Shanghai,China)另行偵測D-dimer的量。
    單株抗體6H11於小鼠體內促使纖維蛋白溶酶活性變化結果如圖3A所示。注射單株抗體6H11小鼠血液中可測得較控制組高出1.5倍之OD405讀值，因此顯示注射有單株抗體6H11的老鼠體內較控制組老鼠具有較高量的纖維蛋白溶酶的活性。
    注射單株抗體的小鼠體內D-dimer的生成情形係如圖3B所示。控制組小鼠體內的D-dimer平均約為8.668±0.3679 ng/ml，而注射單株抗體6H11的實驗組小鼠體內的D-dimer平均約為15.52±0.9072 ng/ml(p=0.0015)。顯示，注射單株抗體6H11能使小鼠體內的D-dimer增加。
    由於D-dimer是纖維蛋白被分解後之產物，故參考實驗例三之結果可知，單株抗體6H11能促使小鼠體內的纖維蛋白溶酶原活化而生成纖維蛋白溶酶，並使纖維蛋白原及纖維蛋白分解。
    本發明所提供之所有實驗例的統計數據，均採進行三次重複試驗，所得數值係取平均值±SD(標準差，standard deviation)計算而得。Student’s t檢定(student’s t test)用以判別實驗組與控制組間的顯著差異，當p<0.005時，視為兩者間具有顯著差異。
    綜上所述，本發明所提供之抗體，能結合纖維蛋白溶酶原，並藉以由活化纖維蛋白溶酶原轉變為纖維蛋白溶酶，再透過纖維蛋白溶酶的酵素活性降解纖維蛋白原及/或纖維蛋白，因而能分解血管中的血栓或其他纖維蛋白凝結物，避免堆積而阻塞血流。是以，本發明所提供之抗體可用於治療或預防中風、心肌梗塞、或其他血栓引發的疾病，以提升健康品質，取代傳統具有高副作用風險的療法。
    以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
    <110>　國立成功大學
    <120>　活化纖維蛋白溶酶原之抗體、其用途與製備方法以及含有其之製劑
    <160>　1
    <170>　PatentIn version 3.5
    <210>　1
    <211>　250
    <212>　PRT
    <213>　小鼠融合瘤細胞株
    <221>　胜肽
    <222>　(1)..(250)
    <400>　1


    圖1為本發明之單株抗體6H11對登革病毒及纖維蛋白溶酶原之專一性測試數據圖；
    圖2A為本發明之單株抗體6H11活化纖維蛋白溶酶原之濃度依賴分析數據圖；
    圖2B為本發明之單株抗體6H11活化纖維蛋白溶酶原之時間依賴分析數據圖；
    圖2C為本發明之單株抗體6H11絲胺酸蛋白分解酶活性分析之數據圖；
    圖2D為本發明之單株抗體6H11於尿激酶共同作用促進活化纖維蛋白溶酶原速率之數據圖；
    圖2E為本發明之單株抗體6H11之分解纖維蛋白原之實驗結果圖；
    圖3A為小鼠注射本發明之單株抗體6H11後纖維蛋白溶酶量變化之數據圖；以及
    圖3B為小鼠注射本發明之單株抗體6H11後體內纖維蛋白分解產物D-dimer濃度變化之數據圖。
    权利要求:
    Claims (14)
    [1] 一種活化纖維蛋白溶酶原的抗體，其係由寄存於食品工業研究所編號BCRC 960433之融合瘤細胞所產生。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該融合瘤細胞係利用骨髓瘤細胞與登革病毒免疫化脾臟細胞融合產生。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其係對一胺基酸序列具有專一性，該胺基酸序列係至少包括白胺酸-脯胺酸-X-脯胺酸，其中X係為任一胺基酸殘基。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其同時具有登革病毒E蛋白與該纖維蛋白溶酶原結合能力。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其係藉由絲胺酸蛋白分解酶活性活化該纖維蛋白溶酶原以生成纖維蛋白溶酶。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其係與纖維蛋白溶酶原活化子共同作用。
    [7] 一種如申請專利範圍第1項至第6項任一項所述之抗體用於治療或預防中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之用途。
    [8] 一種如申請專利範圍第1項至第6項任一項所述之抗體用於溶解纖維蛋白之用途。
    [9] 一種用於治療中風、心肌梗塞、或血栓性疾病之製劑，其至少包括如申請專利範圍第1項至第6項任一項所述之抗體。
    [10] 如申請專利範圍第9項所述之製劑，其更包括一安定劑、一活化劑、一界面活性劑、一抗氧化劑及/或防腐劑、或一纖維蛋白溶酶原活化子。
    [11] 一種活化纖維蛋白溶酶原之抗體的製備方法，包括以下步驟：利用一登革病毒免疫一動物；融合該動物之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞；以及篩選生產對登革病毒E蛋白或該纖維蛋白溶酶原具專一性之抗體之融合瘤細胞，並取得該抗體。
    [12] 如申請專利範圍第11項所述之製備方法，其中該登革病毒E蛋白或該纖維蛋白溶酶原具有一胺基酸序列，其係至少包括白胺酸-脯胺酸-X-脯胺酸，其中X係為任一胺基酸殘基。
    [13] 如申請專利範圍第11項所述之製備方法，其中該抗體係藉由絲胺酸蛋白分解酶活性活化纖維蛋白溶酶原以生成纖維蛋白溶酶。
    [14] 如申請專利範圍第13項所述之製備方法，其係與纖維蛋白溶酶原活化子共同作用。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US20130129744A1|2013-05-23|
    US8784820B2|2014-07-22|
    TWI427085B|2014-02-21|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2017-11-21| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161554786P| true| 2011-11-02|2011-11-02||
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